【文献解读】一种在96孔板中将人诱导多能干细胞分化为功能性心肌细胞的方法

人多能干细胞（hPSCs），包括人胚胎干细胞（ESCs）和人诱导多能干细胞（iPSCs），在药物研发和疾病以及组织发育研究中的应用逐渐增多。人多能干细胞（hPSCs）的一个重要特点是它们能够分化成几乎任何类型的细胞，包括心肌细胞。之前的研究表明，源自干细胞的心肌细胞具有与人原始心脏组织相似的特性和功能属性。单层定向分化，结合小分子化合物和明确定义的培养基，已经提高了以相对高纯度（>80%）产生心肌细胞的效率，而无需额外的生长因子。然而，分化效率的变异和低重复性仍然存在问题，这些问题已被归因于初始接种密度、细胞密度和分化过程中使用的化合物的批次变异等。此外，人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞（hiPSC）系列中的内部和间部克隆变异，如基因和蛋白质表达、DNA甲基化和分化潜力的差异，对分化效率产生重大影响。

2020年10月28日挪威卑尔根大学临床医学系LaurenceA. Bindof团队在scientific reports上发表了文章A method for differentiating human induced pluripotent stem cells toward functional cardiomyocytes in 96‑well microplates该研究在96孔板中使用明确定义的培养基和小分子化合物进行心肌细胞分化。与较大的培养板相比，96孔板提供了更多的重复实验机会，从而增加了重复性的潜力，同时仍然具有经济高效的特点。

由于分化产量受到人胚胎干细胞（hESCs）/人诱导多能干细胞（hiPSCs）的质量、基质胶、培养基、小分子、细胞密度和细胞汇合度的影响，我们在96孔板中评估了这些因素。我们使用了两种hESC系（H1和H9）和两种hiPSC系：Detroit 551-A和AG05836B-151。为了考虑所采用的重编程方法可能存在的潜在差异，我们使用了一个通过逆转录病毒重编程的细胞系（Detroit 551-A）和一个无整合仙台病毒重编程的细胞系（AG05836B-15）。此外，我们分别将传代基质胶和培养基更改为Geltrex和Essential 8 Medium（E8）。（图1A）显示了分化的时间线和所使用的培养基和小分子，以及心肌细胞发育标志物和克隆形态（图1B）。

图1.心肌细胞诱导分化时间线

我们对细胞密度的研究表明，当分化起始时的细胞密度分别为30-40％、60-70％和80-90％时，60-70％的细胞密度在分化第15天（D15）产生了功能性心肌细胞百分比最高的培养物（图2）。然后，我们估算了在细胞接种后至少2天内覆盖60-70％孔板面积所需的细胞密度。接种包括将hPSC集落溶解成单细胞悬浮液和/或小团块，其中含有两到六个细胞，使用E8培养基，并添加Y27632。在这种组合下，细胞在37°C下孵育过夜，24小时后将培养基更换为新鲜的E8培养基。因此，估算接种密度需要至少2天的培养时间，以为细胞恢复和达到所需的细胞密度提供足够的时间。我们确定，对于hESCs和hiPSCs，2.4×104个细胞/cm²的密度对于在分化第7天和第9-10天的大面积心肌细胞的跳动区域是最佳的。在这些实验中使用的细胞系在2-3天内的细胞性为60-70％，然而，其他细胞系的最佳细胞性的时间可能会有所不同。此外，我们还注意到，如果不调整小分子CHIR99021的浓度，细胞性的任何偏差都会导致细胞死亡增加或分化效率降低。我们发现，对于hESCs来说，8μM的浓度是最佳的，而对于hiPSCs，6μM的CHIR99021在D15时产生了高水平的TNNT2+细胞。

hESCs/hiPSCs在无线饲养条件下在Essential 8培养基（E8）中以每平方厘米2.4×104个细胞的密度传代在Geltrex上。在3天内，它们达到了60-70％的细胞性，这是通过以依赖于细胞浓度的方式应用GSK3抑制剂CHIR99021诱导分化的理想时间点。WNT蛋白抑制剂-2（IWP2）在诱导分化后的72小时后添加，持续48小时。第5天提供新的培养基（不含胰岛素的RPMI/B-27），从第7天开始，每隔两天用新的RPMI/B-27（含胰岛素）培养细胞（图1）。我们观察到在第7天出现了跳动的心肌细胞区域，而在第9-10天，可以在孔板的大面积区域看到自发的收缩。自第10-15天收集了可收缩的心肌细胞以供进一步分析。

图2.细胞融合度对心肌细胞分化的影响

为了评估整个分化过程中的发育标志。从hPSC向心脏谱系的分化涉及到原始褶皱样群体的形成，从中发育出所有内胚层和中胚层谱系，包括心血管祖细胞，如心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。为确保分化遵循正确的发育路线，我们在时间点上监测了关键标志物的表达水平，这些时间点对应于特定阶段的转变，包括多能状态（D0）、生殖层特异性（D3）、前体状态（D5）和心肌细胞（D15）在ES系H1（图3）。如预期，使用CHIR99021处理hPSC导致了多能性基因NANOG和POU5F1的表达下降，并且在分化的D3时出现早期中胚层标志物，如MESP1、MIXL1和T的高水平（图3，附图S2和S3A）。H1和Detroit 551-A的进一步分化是由D5上ISL1和TEMEM88表达的增加来定义的，而心肌细胞的分化则由特定标志物（如TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7）来定义（图3，附图S2和S3A）。基因表达层面显示，当细胞从生殖层特异性（D3）向心肌细胞（D15）发展时，GATA4和ATP2A2的表达逐渐增加，心脏特异性标志物TNNT2和MYL7的表达与成熟和收缩活动相吻合（图3，附图S2和S3A）。这些研究还显示了MYL2（心室肌细胞的标志物），从第12天开始存在（附图S3A）。

为确保我们看到的是适当的成熟，我们研究了成熟心肌细胞标志物（如HOPX和MYH7）在分化的较晚阶段，即D30。我们表明HOPX和MYH7在分化的D30时增加，而MYH6下降（附图S4）。

图3.通过基因表达鉴定H1来源的心肌细胞

我们对hPSC进行了多能性评估，并在分化开始之前的hPSC（第0天）中发现POU5F1的表达，但没有TNNT2心肌细胞标志物的证据。在分化过程的第7天，我们观察到POU5F1的表达显著减少，并出现了心肌细胞标志物TNNT2（附图S3B）。接下来，我们通过评估ISL1和NKX2-5的表达来评估心脏谱系的细胞，这些基因定义了心脏前体阶段。我们发现在分化的第6天有ISL1和NKX2-5阳性细胞（图4A），而在第10天可以强有力地检测到TNNT2（图4A）。使用MYL7抗体染色，这是心房肌细胞的特异标志物，显示了分化第10-12天内的细胞中存在心肌肌节（图4B-ii）。此外，我们在分化第10-12天内的TNNT2+细胞中发现了Connexin 43（GJA1）的表达，这是缝隙连接标志物（图4B-iii）。MYL7和心肌细胞特异性标志物肌钙蛋白I3（TNNI3）的共染色（图4B-iv）证实了在分化第10-12天的培养中存在已承诺的心肌细胞。

图4.心肌细胞表征

在心脏谱系分化期间形成的主要细胞类型包括心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。在分化后期（第12-19天）对心肌细胞的标志物（TNNT2和MYL7）进行共染色显示，H1培养的细胞中82±7%和60±10%呈阳性，而Detroit551-A培养的细胞中85.7±3%呈TNNT2阳性，79.7±3%呈MYL7阳性（图5A）。根据流式细胞术的结果，H9的分化效率低，TNNT2阳性细胞为47±13%，MYL7阳性细胞为45%。然后，我们在第15天为心肌细胞染色，使用CDH5（内皮谱系标志物）和ACTA2（平滑肌）标志物。这项分析确认了平滑肌和内皮细胞的存在，这些细胞在心脏谱系分化期间预计会成为副产物（图5C）。

我们使用流式细胞术在第15天研究了心脏培养中内皮和平滑肌细胞的相对比例。表面标志物CD144和CD140b分别用于鉴定内皮和平滑肌。同时，来自同一96孔板的样本用心肌细胞标志物TNNT2染色，以估计心肌细胞的数量（图5B）。在H1来源的心肌细胞培养中，74.5±8%为TNNT2阳性细胞，9.5±2.94%染有平滑肌标志物（CD140b），只有3.71±0.81%的细胞表达内皮标志物（CD144）（图5B）。在Detroit 551-A培养中，TNNT2阳性细胞比例为77±0.18%，CD140b阳性细胞比例为18.45±0.1%，内皮细胞比例为5.53±0.02%。在AG05836B-15培养中，67.2±0.2%为TNNT2阳性细胞，而21±0.1%和2±0.007%的细胞分别为CD140b和CD144标志物阳性（图5B）。

图5.使用流式细胞术分析验证心肌细胞分化

为了研究孔间的异质性，我们从多个孔中提取了RNA，并进行了qPCR以评估相对于一个内参基因GAPDH的TNNT2和NKX2-5的表达。我们随机选择了12分化孔，使用MagMAx分离试剂盒提取总RNA。我们观察了H1的两次分化试验，第一次分析了一个板的12个孔，而在第二次试验中，我们分析了3个不同板的多个孔。我们还从Detroit 551-A分化的心肌细胞分别提取了3个不同板上多个孔的RNA。这些数据在在线附表S1中显示。变异性如图6所示，我们计算了这些CT值之间的变异系数，变异系数在1.96%和7.30%之间变化，确认了每个孔中的心肌细胞数量相似。

图6. 96孔板中不同分化过程中的孔间异质性研究

心脏功能，包括节奏性和收缩性，依赖于多种离子通道的表达，如钠、钾和钙通道。为了测试分化的心肌细胞是否具有适当的电生理特性，我们采用了微电极阵列（MEA）并使用不同的心脏药物对它们进行挑战。微电极阵列提供了一种高度敏感的、非侵入性的方法，用于研究电活性细胞的生理特性。MEA记录了称为细胞外场电位（FPs）的电波信号，这些信号是由心肌细胞的单层或小簇产生和塑造的。FP轮廓代表心脏动作电位，并在某种程度上反映了心电图记录。通常情况下，人们会看到与Na+流入（R/Q峰）和膜去极化相对应的迅速上升部分，一种被认为对应于Ca2+流入的慢波/台段，以及与主要的K+流出（T峰）相对应的复极化阶段（图7A）。

我们在分化的第11-13天将H1和Detroit551-A衍生的心肌细胞转移到MEA仓，并在接下来的14天内（分化的第12-26天）监测其稳定性和心跳一致性特征。观察期的选择基于先前的研究，这些研究表明将心肌细胞转移到MEA仓以检查它们的电生理活动的最佳分化阶段是第11-13天。

H1衍生的心肌细胞显示了平均FP持续时间为298±20毫秒，心跳间隔（BI）为42±2次/分钟，而Detroit551-A衍生的心肌细胞则显示了平均FP持续时间为75±5毫秒，BI为49±4次/分钟。随着培养的时间延长，心跳间隔变得更加不规则，这如先前所述。为了测试hPSC衍生的心肌细胞的功能，我们应用了以下药物：β1和β2肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素（1 µM）、钾通道拮抗剂E4031（1µM）、钠通道拮抗剂（TTX，5 µM）、L-型钙通道拮抗剂硝苯地平（5nM）以及5-羟色胺（血清素）受体-HT4激动剂和HT3拮抗剂Mosapride（350nM）（图7Biv）。尽管Detroit 551-A应用的药物较少，但这些细胞在应用异丙肾上腺素和E4031后表现出相同的电生理模式改变。

正如预期的那样，异丙肾上腺素增加了心跳频率，并显著减少了FP持续时间（FPD，图7Bi，表1）。如预期，E4031降低了FP幅度（FPA，图7Bii，表1），但与其他报告相反，我们观察到FP持续时间（FPD）增加并轻微延长了心跳间隔5,24。应用TTX导致了正峰幅度（pPA）显著降低，增加了FPA，延长了BI，但对FPD没有影响（图7Biii）。硝苯地平的行为与描述一致，降低了pPA和FPD，但对BI没有影响（图7Biv）。Mosapride影响了FPA，并显著降低了FPA/FPD比率，也称为场电位幅度上升速度（FPUS），这是钠和L型钙通道功能的指标。

图7.hiPSC来源的心肌细胞的MEA记录

总之，本研究改进了将人多能干细胞诱导分化为功能性心肌细胞的方案，将其适应到96孔板中。由此产生的心肌细胞在转录和蛋白水平上表达心脏特异性标志物，并具有电生理特性，证实了功能性心肌细胞的存在。

https://www.nature。。ｃｏｍ/articles/s41598-020-73656-2

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