小鼠胆管类器官

产品信息

其他自备材料和试剂

MG&ABW基质胶

组织消化液

上皮类器官基础培养基

类器官消化液

小鼠肝胆管(扩增)类器官培养基

类器官冷冻保存培养基(无血清)  

DPBS (1X)，液体，不含钙和镁  

FBS（胎牛血清）

EDTA

小鼠肝胆管类器官扩增培养基和稳态培养基的制备

采用无菌技术制备小鼠肝胆管类器官扩增培养基和稳态培养基。在小鼠肝胆管类器官扩增培养基中生长的小鼠肝胆管类器官绝大多数是肝胆管细胞。

以下是准备 10mL培养基的示例，如所需量不同，可相应调整用量。

1.冰上解冻小鼠肝胆管类器官培养因子B、小鼠肝胆管类器官培养因子C。

注意： 解冻后，建议将小鼠肝胆管类器官培养因子B、小鼠肝胆管类器官培养因子C分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2. 配制小鼠肝胆管类器官扩增培养基，专门用于原代培养和复苏。添加200 μL小鼠肝胆管类器官培养因子B (50x)、40 μL小鼠肝胆管类器官培养因子C (250x)至9.76 mL小鼠肝胆管类器官基础培养基中，混合均匀。

注意：配制后的小鼠肝胆管类器官培养基可在 2-8°C 储存，建议在两周内使用。小鼠肝胆管类器官培养因子B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠肝胆管(分化)类器官的培养

小鼠肝胆管类器官原代培养

从初级组织中建立类器官

1. 使用离心管将原代小鼠肝胆管组织收集在冰冷的原代组织储存液中，将组织样本保存在4°C，直到开始分离。

2. 评估获得的组织碎片是否由上皮组织组成。如果存在脂肪或肌肉组织，请在解剖显微镜下使用手术剪刀或手术刀和镊子尽可能多地去除这些非上皮成分。如果没有脂肪或肌肉组织，请立即继续下一步。

3.用上皮类器官基础培养基或DPBS冲洗肝肝胆管组织，直到上清澄清。

4. 在腺窝结构分离之前，将基质胶解冻并保持低温。加入5 mL FBS至45 mL上皮类器官基础培养基中制备10%FBS培养基。

5. 将组织在细胞培养皿中使用外科剪刀或手术刀切成5mm³的小碎片。

6.将分离的样品放入一个15毫升的离心管中，管中含有10ml预冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗样品至少10次。

注：在接下来的步骤中，使用10%FBS培养基润洗10ml移液管的内表面以避免样品粘在移液管壁上。

8.让管子静止不动，直到样品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL预冷DPBS。

9. 重复步骤7和8 3-5次，直到上清清澈。

注：清洗样品是避免细菌污染的关键。

10. 向试管中加入10ml预冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在摇床上，在4°C的温度下轻轻摇动40分钟。

11. 用EDTA处理后，保持试管静止，直到样品沉淀到试管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml预冷DPBS。

12. 让管子静止不动，直到样品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml预冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隐窝结构会通过移液吸头释放到上清液中。将含有分离的隐窝的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml预冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允许组织碎片在正常重力下下沉至少30秒钟。隐窝被通过移液释放到上清液中。将含有分离的隐窝的上清液放入一个新的15ml管中。

15. 在4℃、400g条件下离心3分钟。吸出并丢弃上清。

16. 将沉淀重悬在1ml DPBS中，并将隐窝悬浮液转移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隐窝重悬液到培养皿中。在立体显微镜下计数隐窝的数量并计算隐窝的总数。

17. 在4℃、400g条件下离心3分钟。吸出并丢弃上清。

18. 吸取上清，将沉淀重悬于基质胶中。基质胶应保存在冰上以防止固化。推荐重悬密度为每 25 μL基质胶悬液包含 100 - 500 个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30 s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

19. 将基质胶和组织细胞小心均匀混合以防止气泡产生并将悬液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

20. 将接种完成后的培养板置于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15 -25min 左右待基质胶凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前预热的小鼠肝肝胆管类器官扩增培养基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 无菌水， 置于 37℃温箱、5% CO2条件下培养。

注意：请沿孔壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

22. 每 3 d 更换一次培养基，从孔中小心地吸出培养基，并用新鲜的、预热过的有机培养基替换，更换培养基时应避免破坏基质胶。

23. 密切监测类器官生长状态，理想情况下小鼠肝胆管类器官应在 5 - 8 天内建成。

小鼠肝胆管类器官传代培养

1. 用经过润洗液润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经 过润洗液润洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用经过润洗液润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，使得类器官与基质胶分离。

3.200g 离心力室温离心 3min。

4.弃上清，使用类器官消化液或用机械破坏。对于使用类器官消化液的细胞解离，在类器官消化液中重悬类器官悬浮液，移液器反复上下吹打并置于37°C孵育，直至类器官解离。使用带滤芯移液头每2分钟反复上下吹吸8次，以帮助破坏类器官。密切监视消化过程使在类器官解离液中的孵育时间最短。如发生机械故障，在1.5 mL上皮类器官基础培养基中重悬类器官悬液。小心地用移液管吸取类器官悬浮液，反复上下30次，这将有助于消化。

警告:不要在类器官消化液中解离超过3分钟，因为这可能会导致较差的类器官的生长甚至破坏。根据经验，如果是小块细胞的混合物，可以观察到由10-50个细胞组成的细胞团，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮类器官基础培养基进行一次冲洗，然后室温下200g离心3分钟。

6. 弃上清，用适量的基质胶重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过 30s 以避免基质胶过早凝固。

注意：基质胶稀释比例应在 70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。

7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入 24 孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔 30uL 左右。

注意：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。

8. 将接种完成后的培养板至于 37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育 15min 左右待基质胶凝固。

9. 配制小鼠肝胆管类器官稳态培养基，并在37°C预热。

10. 待基质胶凝固后，加入已预热的小鼠肝胆管类器官培养基，24 孔板每孔 500uL。

11. 将 24 孔板置于 37℃二氧化碳培养箱中培养，直到类器官需要进一步的实验。