0827775 干细胞 类器官用基质胶

0827775 干细胞 类器官用基质胶推荐的应用：

干细胞培养，如hESC,iPSC,提供人胚胎干细胞和诱导多功能性干细胞无滋养层培养所需的可重复性和一致性。

产品货号：0827775

中文名称：ABW基质胶  干细胞

产品规格：5ml

产品品牌：ABW

0827775 干细胞 类器官用基质胶可运用领域：

1.类器官培养  2.血管生成实验  3.细胞侵袭实验，Transwell实验    4.PDX，CDX模型实验  5.愿为肿瘤移植，皮下成瘤实验  6.干细胞培养及细胞分化研究  7.其他待开发实验类型

ABW® 诱导多能干细胞培养方案

ABW® Induced Pluripotent Stem Cell（iPSC）Culture Protocols

一、培养材料

1、试剂：ABW® Matrigengel（REF: 0827775）；ROCK 抑制剂（Y-27632）；DMEM F12/DMEM；mTeSR1/E8培养基；Accutase解离剂、PBS(D-PBS）

2、耗材：无菌枪头；六孔板；无菌EP管。

二、培养准备

1、材料预冷：

a、将ABW® Matrigengel 置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使胶能过夜缓慢融化;

b、4℃预冷无菌离心管、无菌枪头、六孔板、DMEM F12/DMEM；

2、将ABW® Matrigengel（REF: 0827775）以1：80或1：100比例进行稀释：

a、将适量4℃的DMEM F12/DMEM移入冷却的15/50 mL EP中;

b、使用移液器将预冷的枪头从EP管吸取DMEM F12/DMEM中移入分装好的ABW® Matrigengel，再吸取转移至EP管内；重复几次，直到基质胶*移入到EP管中。

c、按比例混合后作为储备基质胶混合液，进行后续铺板；

3、制作基质胶涂层

a、按1mL/孔将基质胶混合液加入预冷的六孔板中，轻轻晃动以确保混合液均匀铺在板上；

b、将6孔板转移到37℃孵育过夜（板材可以在孵育一小时后即可使用，但过夜孵育的涂层对细胞培养效果更佳）；

c.使用前吸去涂层上方液体。

4、配置ROCK 抑制剂（Y-27632）工作液：使用无菌PBS将Y-27632溶解，配置成10mM溶液（1000X），工作浓度为10μM;

5、配置含ROCK抑制剂mTeSR1/E8培养基：将10mM溶液加入mTeSR1/E8培养基至终浓度为10μM。

注意：ABW® Matrigengel在>4℃时会逐渐聚合成胶，请严格把控操作温度，控制操作时间；稀释后的基质胶混合液同样需要冰上操作。

一、细胞培养

1、复苏iPSC

a.从液氮罐或干冰中取出ipsc，37℃水域中解冻，解冻应迅速完成；

b.用75% 酒精消毒冻存管后转移到超净台/生物安全柜；

c.将细胞溶液转移到新的15ml EP管中，用DMEM F12/DMEM冲洗冻存管两次

d.室温 300g 离心5min（ipsc对于200-300g的转速都有较好的耐受性，建议使用300g来最.大限度捕捉细胞，标准程序下建议使用200g）;

e.弃上清，用2mL含有ROCK抑制剂的培养基轻柔地重悬iPSC后转移到用铺好板的孔中，前后摇动使得细胞均匀分布（建议将每瓶细胞1*10 6装在六孔板的一个孔内使细胞存活率最D化）

f.将六孔板放回37℃培养箱，（请在细胞被转移后立即执行，避免细胞中.央密度增加）

g.次日撤去ROCK抑制剂，即用无抑制剂的培养基替代含抑制剂的培养基培养细胞。

注意：细胞培养过程中不提倡使用抗生素，其会干扰细胞和其分化潜能；培养环境应与其他细胞隔离，两次传代后检测支原体；DMSO在室温下对细胞有毒，复苏步骤应快速完成

2、iPSC传代

a.将培养上清吸去，用1mL的PBS清洗后加入1mL Acuutase；

b.转移到37℃培养箱3分钟，或在显微镜下观察直到大部分细胞脱落（若细胞仍然附着，可将培养板放在手上，另一手轻轻在你的手上拍打使板发生轻微震动从而使细胞脱落）；

c.传代前准备好基质胶涂布的六孔板

d.倾斜培养板，将Accutase溶液沿培养层表面转移两次，分离结块并转移到离心管中

e.用DMEM F12/DMEM冲洗培养层表面，并与管中的细胞溶液合并（使用DMEM/F12或用PBS洗涤，建议使用至少5%的培养基，有利于随后的造粒和附着）；

f.室温下 300g 离心五分钟

g.吸去上清，用含有ROCK抑制剂的培养基进行重悬；

h.将细胞加入到涂层板中，轻轻摇动使细胞分布均匀；

i.将培养板放入37℃培养箱中孵育。

注意：IPSC生长为单层后则会迅速分化并死亡，为了保持生长和多能性，需在其长满前进行传代。

3、iPSC细胞冻存

a.准备细胞和解离液，在解离液解离细胞过程中，将培养基与10%DMSO混合，在冻存管上贴好标签，配置好冻存液（可选20%血清或血清替代物提高存活率， 也可以使用90%胎牛血清+10%DMSO）；

b.分离细胞方法同传代，可以使用细胞计数器来配合进行细胞的冻存；

c. 以1X10^6 冻存每管细胞，之后进行离心、抽吸培养基，然后在适当体积的冻存液中进行重悬；

d.将1ml重悬好的细胞冻存液加到1.5ml冻存管中，并进行程序性降温，在液氮罐中长期保存。